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超净工作台在纤维细胞生物学实验的使用
发布时间:2012-06-04 08:52:49   浏览:3422

超净工作台在纤维细胞生物学实验的使用

近年来,随着组织工程及再生医学的迅猛进展脂肪干细胞鉴于其取卡材便利,来源丰富,低免疫性及多分化潜能等诸多优点,已成为人们研究的热门。但以往的研究大多集中在ADSCs多分化潜能在组织工程和再生医学中的应用,很少关照ADSCs分泌功能在组织损伤修复中的作用。本实验通过使用超净工作台并观测研究了ADSCs分泌功能对成纤维细胞的生物学影响,探讨ADSCs分泌功能促创面愈合的机制。


材料和方法

1 主要仪器与试剂:DMEM培养液、胰酶、I型胶原酶、二甲基亚砜、MTT、小牛血清,胎牛血清,annexinV凋亡检测试剂盒,Mondel680型酶标仪,垂直流超净工作台,CO2细胞培养箱,颠倒显微镜,流式细胞仪。

2 ADSCs分离与培养:取腹部外科手术患者皮下脂肪组织约59,无菌条件下用剪刀剔除血管及其它组织碎片,用含双抗的PBS液反复浸泡冲洗3次,每次约5min,用眼科剪将脂肪组织剪成约lmm3的碎块,置于0.1%的I型胶原酶中于37℃水浴振荡消化1h;加入等体积l0%胎牛血清精细消化后,用200目的细胞筛网过滤,600g离心lOmin,弃去上层脂肪及上清液,沉淀用含l0%胎牛血清培养液重悬接种于培养瓶,置于37℃、5%的C02培养箱中陈规培养。2天后换液,细胞长满80%时传代培养。

3 3ADSCs培养上清液的制备:选择生长良好第3代.ADSCs细胞接种于75cm2的培养瓶,生长至80%融合时,换成尢血清培养液DMEM15ml,培养3天后,搜集上清液。上清液经O.22μm的滤膜过滤.分装,一80。C冻存备用。

4 人皮肤成纤维细胞的培养:用组织块法培养原代细胞,置于10%小牛血清培养液中,置于37℃、5%C02培养箱中陈规培养。

5 成纤维细胞增殖的测定:采纳MTT法测定。传代时取第3代成纤维细胞以3×10/孔接种于12孔板,陈规培养24h后弃上清,设实验组及对比组,实验组均用ADSC-CM及2%小牛血清配制,对比组仅用2%小牛血清培养液,每组设3个复孔。各组加对应的培养液lml,连续培养3天后,每孔分别加入5g/L的MTT100μl,37℃、5%C02孵育4h后,精细培养:吸弃上清液,每孔加入750μl。二甲基亚枫,连续孵育lOmin后稍微振荡使紫蓝色沉淀融解,然后以150μl/孔移动至96孔板,每孔反复5次。用酶标仪测定490nm波长下的吸光度值。

 原文来源:http://www.fenglins.com/

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